가용성 Fab 클론의 유전자형 기능 스크리닝을 통해 다음이 가능해졌습니다.

Scientific Reports 13권, 기사 번호: 13107(2023) 이 기사 인용

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측정항목 세부정보

단일클론 항체(mAbs)와 그 단편은 치료, 진단 및 기초 연구에 널리 사용됩니다. 파지 디스플레이와 같은 디스플레이 방법은 높은 처리량을 제공하지만 개별 항체의 친화성은 수용성 형식으로 정확하게 측정되어야 합니다. 우리는 계층적 인덱싱을 갖춘 차세대 시퀀싱(NGS)을 사용하여 총 9216개의 가용성 개별 항원 결합 단편(Fab) 클론으로부터 유전자형 기능 데이터를 제공할 수 있는 스크리닝 플랫폼을 개발했습니다. 전체 길이의 쌍을 이루는 가변 도메인 서열(VL-VH)은 기능적 스크리닝 데이터에 연결되어 돌연변이 효과에 대한 심층 분석을 가능하게 합니다. 플랫폼은 4개의 파지 디스플레이 선택 scFv/Fab 스크리닝 프로젝트와 1개의 사이트 포화 VH 친화성 성숙 프로젝트에 적용되었습니다. 유전자형 기능적 스크리닝은 동시에 뎅기열 바이러스 비구조 단백질 1(NS1) 혈청형 2를 인식하는 Fab 49A3의 VH 도메인에서 친화도 개선 돌연변이의 식별을 가능하게 하고 친화도 감소 없이 야생형에서 변경될 수 없는 VH 잔기 위치에 대한 정보를 제공합니다. 유전자형 기반 식별을 통해 현장에서 종종 간과되는 현상인 단일 지점 스크리닝 데이터에 내재된 클론 내 신호 분산의 정도가 밝혀졌습니다. 더욱이, 유전자형 스크리닝은 추가 연구를 위해 동일한 유전자형의 중복 선택을 제거하고 파지 디스플레이 선택의 성공과 스크리닝된 레퍼토리에 남아 있는 클론 다양성을 평가하기 위한 새로운 분석 도구를 제공했습니다.

재조합 항체 공학은 생명공학 분야의 성공 사례입니다. 단클론 항체(mAbs)와 단일 사슬 가변 단편(scFv) 및 단편 항원 결합(Fab)과 같은 단편은 치료, 진단 및 기초 연구 도구로 널리 사용됩니다1. 이러한 용도를 위한 새로운 표적 분자가 발견됨에 따라 높은 친화력, 특이성 및 원하는 물리화학적 특성을 지닌 새롭거나 향상된 결합제가 필요합니다.

더 작은 크기의 항체 단편과 Fc 도메인의 결여는 전체 크기의 IgG에 비해 더 나은 조직 침투2,3 및 체외 진단 분석에서 더 적은 간섭 가능성을 포함하여 여러 가지 이점을 제공합니다4. 항체 공학의 관점에서 볼 때 항체 단편의 단순한 구조의 주요 장점은 E. coli에서 경제적이고 손쉬운 발현이 가능하여 파지 디스플레이에 사용할 수 있다는 것입니다5. 높은 처리량 표시 방법과 결합된 고급 재조합 항체 유전자 라이브러리 기술6,7은 다양한 표적8에 대해 결합제를 강화하는 효율적인 방법을 제공합니다.

디스플레이 방법은 높은 처리량을 갖고 있지만 개별 결합제의 친화력과 특이성은 수용성 형식의 다수의 개별 항체를 스크리닝하여 평가해야 합니다. 파지 디스플레이 항체 단편이 가용성 형식으로 변환된 후 일부 연구에서 특이성 상실이 보고되었습니다9,10. 이는 디스플레이10에 대한 scFv의 가장 일반적인 융합 파트너인 pIII 단백질의 지지를 잃은 후 scFv의 변형된 형태로 설명될 수 있습니다. 또한 scFv에서 IgG 형식11,12으로 직접 변환한 후 친화력이 손실되어 발견된 항체의 적용 영역이 크게 제한된다는 보고도 있습니다. 또한, scFv의 의도하지 않은 다중화는 결합력 효과를 통해 더 강한 결합을 유도하는데, 이는 패닝 또는 용해성 스크리닝에서 바람직하지 않습니다13,14. 그러나 Fab는 일반적으로 친화도 분석을 위한 이상적인 스크리닝 형식인 단량체 분자로 간주되며, 여러 개의 표시된 Fab가 있는 파지 입자의 존재를 배제할 수는 없지만 결합력 효과로 인한 농축 위험은 scFv보다 Fab의 경우 더 낮습니다. 파지 라이브러리13. 신뢰할 수 있는 친화력 추정 외에도 가용성 스크리닝을 통해 발현 수준이 좋은 클론을 식별할 수 있습니다.

3) among the phage display selected libraries. Among genotypes encountered at least three times in the screening campaign, 66.7% did not bind to the SpyCatcher-antigen (S/B < 3), whereas, of the remaining genotypes, 28.9% showed S/B-ratio both above and below the set threefold threshold ratio, and 4.4 % were positive (S/B > 3) in all instances (6.7% if calculated by S/B > 2). On the contrary, anti-DARPin library was over enriched in relation to the number of clones screened, with only 76 unique genotypes, 43% of which were represented between 2 and 331 times with a standard deviation (SD) of 47. Three genotypes, including one used as control, were present with 170 clones or more. The low number of unique clones in the anti-DARPin Fab repertoire is consistent with the selection scheme, as four rounds of Fab-phage selections were carried out with the anti-DARPin library in contrast to three with anti-SpyC library and one to two with anti-NP libraries. The genotype copy numbers per library are shown in Fig. 2b./p> 3) and distribution of functional screening data differed between the phage-derived screening projects. Despite undergoing 4 + 4 rounds of phage display, it appears that the anti-SpyCatcher library was not fully enriched and could have potentially benefited from an additional round of phage display selection or a reconsideration of the selection strategy. The selection campaign involved various antigens, including chemically biotinylated SpyCatcher, scFv-SpyCatcher, and in vivo biotinylated Spy- and SdyCatcher proteins, aiming to enhance binding towards the catcher rather than the SA-biotin linker. The insufficient enrichment is evidenced by the low number of identical genotypes in the screened set and a relatively low hit rate of 13%. Low hit rate can also be seen in the distribution of the functional signal data (Fig. 2), which is heavily bottom weighted. In the remaining three projects, the hit rates were higher and also the shared genotypes more abundant. In the case of the anti-DARPin library the selection could have been screened after the 3rd round instead of the 4th round of panning, as only a few genotypes were represented in the data, which also had a quite evenly distributed functional signal. NP-1 and NP-2 both come from the same Fab-converted phage library origin, but the functional data between them is very different, with NP-2 having more evenly distributed signals between clones. This was expected, as the last two selection rounds and assay formats were different. NP-2 Fabs were first bound on the wells, followed by addition of biotinylated antigen and detected with Eu-labeled streptavidin, whereas NP-1 Fabs were selected to bind antigen captured by the control Fab N1G1, and the presence of E. coli-expressed Fab-APs was detected with europium-labeled anti-alkaline phosphatase antibody./p>