커뮤니케이션 생물학 6권, 기사 번호: 799(2023) 이 기사 인용
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메탄 생성 물질은 황철석과 같은 금속 황화물로서 전이 금속의 침전을 촉진하여 금속 또는 황 가용성을 감소시키는 흑색(황화물이 풍부한) 또는 철이 풍부한(철이 풍부한) 환경에 서식합니다. 이러한 환경은 지구 역사 전반에 걸쳐 흔히 발생하여 혐기성 생물이 효소 보조인자의 합성을 위해 이러한 요소를 어떻게 얻느냐에 대한 의문을 제기합니다. 여기서 우리는 메탄 생성기가 철과 황의 공급원인 황철석에서 몰리브덴 질소 분해 효소 금속 인자를 합성하여 질소 고정을 가능하게 할 수 있음을 보여줍니다. 황철석으로 성장한 질소 고정 세포는 더 빠르게 성장하고 흑석 조건에서 성장한 세포보다 몰리브덴을 25배 적게 필요로 합니다. 성장 수율은 흑석 조건에 비해 철분 조건에서 성장한 배양물에서 3~8배 더 높습니다. 생리학적, 전사체적, 지구화학적 데이터는 이러한 관찰이 황화물 촉진 금속 제한, 특히 몰리브덴으로 인한 것임을 나타냅니다. 이러한 발견은 몰리브덴 질소 분해효소가 황화물을 적정하여 황철석을 형성하고 보조 인자 생합성을 위한 충분한 철, 황 및 몰리브덴의 가용성을 촉진하는 철 함유 환경에서 유래했을 수 있음을 시사합니다.
질소(N)는 모든 형태의 생명체에서 핵산, 아미노산 및 기타 주요 생체분자의 합성에 필수적입니다. 지구에서 가장 큰 N 저장소는 대기 중의 이질소(N2) 가스입니다. 그러나 생물학적으로 이용 가능하지 않으며 동화되기 전에 질산염(NO3-) 또는 암모니아(NH3)에 고정되어야 합니다. 따라서 고정된 N의 가용성은 생태계의 생산성을 제한하는 경우가 많습니다1. 초기 지구에서 고정된 N은 번개에 의한 대기 N2 산화 또는 N22,3의 광물 환원과 같은 비생물적 과정에 의해 공급된 것으로 생각됩니다. 그러나 이러한 소스에서 고정된 N은 최소화되고 유한했으며 이러한 기능은 이 기간 동안 생태계 생산성이 제한적인 것으로 생각됩니다1. 오늘날 전체 고정 N의 약 50%는 N2 고정이라는 생물학적 과정을 통해 생성됩니다1,4. 이에 따라 N2는 효소 질소 분해효소(디아조트로피)에 의해 NH3로 환원되고 나머지 고정 N은 대부분 산업적 Haber-Bosch 공정을 통해 생성됩니다.
현재까지 세 가지 다른 형태의 질소 분해 효소가 기술되었으며 이는 각 효소 복합체의 활성 부위를 구성하는 (헤테로)금속에 의해 구별됩니다5. 여기에는 몰리브덴(Mo), 바나듐(V) 및 철(Fe)만 포함된 형태의 질소 분해 효소가 포함됩니다6,7. Mo-nitrogenase(Nif)는 분류학적으로 가장 널리 분포되어 있고 가장 오래된 형태의nitrogenase8,9이며 최소한 구조 단백질 NifHDK와 maturase 단백질인 NifB(E)N10으로 구성됩니다. Nif의 활성 부위 금속 클러스터는 6개의 철(Fe)과 9개의 황(S) 원자 코어로 구성되며 Fe는 중앙 탄소 원자를 대칭적으로 배위합니다. 금속 클러스터는 Fe 및 Mo 원자[7Fe-Mo-9S](FeMo-보조인자10,11라고 함)로 덮여 있습니다. FeMo 보조인자 외에도 Nif에는 8개의 Fe 원자와 7개의 S 원자 [8Fe-7S]12로 구성된 복잡한 P 클러스터가 필요합니다. FeMo 보조인자는 각 NifD 구조 단백질 내에 위치하는 반면, P 클러스터는 각 NifD와 NifK의 경계면에서 발견되어 궁극적으로 이종사합체 NifD2K213을 형성합니다. Dinitrogenase reductase인 NifH는 NifD2K2로의 ATP 의존적 전자 전달을 조절하며 두 개의 NifH 하위 단위 각각에 대해 추가 [4Fe-4S] 클러스터를 보유합니다. 따라서 Nif를 통해 N2 고정을 수행하는 세포는 Fe, S, Mo, ATP 및 환원 등가물에 대한 수요가 높습니다.
NifHDK 단백질의 연결에 대한 계통발생학적 분석은 Nif의 가장 초기 진화 계통이 수소영양 메탄생성균에서 발견된다는 것을 나타냅니다. 이러한 관찰은 NifHDK가 보조 인자 F43018을 합성하는 데 필요한 단백질인 CfbCD8의 조상을 암호화하는 유전자의 일련의 복제로부터 진화되었음을 나타내는 다른 데이터에 의해 확증됩니다. F430(및 CfbCD 코딩 유전자)이 고세균 메탄생성균(및 고세균 알카노트로프)에서만 독점적으로 발견된다는 사실은 이러한 고세균의 조상 중 Nif의 기원을 나타내는 추가 증거입니다. 이 데이터는 약 18억~21억년 전(Ga)6,9,17의 고생대 중기 동안 혐기성 메탄생성균의 조상 중 Nif의 기원을 제안하는 데 사용되었습니다. 그러나 셰일에 보존된 유기물의 동위원소 데이터는 > 3 Ga는 훨씬 더 이른 기원을 제안합니다21,22. 실제 기원 날짜에 관계없이, 질소 분해 효소는 초기 지구의 무산소 환경에서 유래한 고대 효소로 해석됩니다. 이 효소의 무산소 기원은 Nif 기능에 필요한 금속 클러스터의 산소 민감성과 일치합니다. Nif는 혐기성 생물 사이에서 다양화되었으며, 진화 역사의 후반부에 산소(O2)를 에너지 대사에 통합할 수 있거나 남세균의 경우 O2를 생산할 수 있는 유기체 사이의 수평적 유전자 전달을 통해 획득되었습니다. 남조류의 증식 및 O2 생산과 관련된 생물학적 생산성의 증가는 고정된 N24의 기존 비생물적 풀에 대한 수요를 증가시켰을 것이며, 이는 대기 중 N2를 줄이고 N 제한을 완화하기 위한 생물학적 메커니즘을 진화시키려는 선택적인 압력이었을 수 있습니다7,25.
2.4 Ga)26,27. This is due to the circulation of hydrothermal fluids through iron-rich mid-ocean basalts, which led to input of a greater amount of Fe(II) into anoxic ocean basin waters than sulfide (HS-)28. In the absence of oxygen, the excess Fe(II) would have been stable, and free Fe(II) concentrations are estimated to have ranged from 0.05 to 0.5 mM29. However, the proliferation of Cyanobacteria and the production of O2 during the late Archean drove the oxidative weathering of continental sulfide minerals that increased the flux of sulfate into oceans. When combined with increased productivity near ocean margins30,31, this would have stimulated heterotrophic sulfate reduction and HS- production. In turn, this led to stratified coastal oceans that were oxygenated at the surface and were euxinic (anoxic and HS--rich) at depth30,31,32. In contrast, deeper ocean waters and those more distal from continental margins remained ferruginous26, due to lower productivity in the overlying water column, decreased availability of sulfate and subsequent heterotrophic sulfate reduction, and hydrothermal input of Fe26,33,34. HS- has a high affinity for Fe(II), resulting in the formation of low-solubility iron-sulfide minerals, including pyrite (FeS2)35,36,37. As such, in euxinic environments, concentrations of HS- exceed that of Fe(II), resulting in the titration and precipitation of Fe(II) as FeS2. Under these conditions, excess HS- is also available to complex with other thiophilic metals (e.g., Mo, Co, Ni), potentially rendering them less bioavailable33,34,38./p>6 mM inhibits N2 fixation in stream sediments72. While this effect was attributed to the toxicity of HS- in cells responsible for N2 fixation, it is plausible that the added HS- influenced the availability of trace metals (e.g., Fe, Mo) required for N2-fixing cells62,73,74,75. A similar effect of HS- on metal availability in N2-fixing MmS2 cultures may explain the lower cell yields and increased expression of Mod genes observed in Fe(II)/HS--grown cells relative to those grown with FeS2. MoO42- is a thiophilic molecule that readily reacts with HS- to form soluble thiomolybdate (MoO4-nSn2-) species that can ultimately be incorporated in sulfide minerals, such as FeS271,76. Such thiolation reactions would be expected to occur under the sulfidic (2 mM) cultivation conditions typically used to culture methanogens77 and that were utilized herein for the Fe(II)/HS--grown cultures. These euxinic cultivation conditions potentially limited the availability of MoO42- such that it did not meet cellular demands./p>400 nM MoO42- was required for growth with an optimum of 4000 nM42. These values are much higher than those required of other N2-fixing organisms. For example, aerobic, N2-fixing cyanobacteria such as Anabaena variabilis81, as well as anaerobic N2-fixing purple sulfur bacteria (PSB) inhabiting the interface of oxic/euxinic waters and that serves as a modern analog of the productive continental margins of Proterozoic oceans82, can be supported by less than 10 nM MoO42-. Interestingly, maximum N2 fixation for the PSB was maximal above the chemocline where HS- was near zero82. Thus, it seems incongruous that methanogens would require 40-fold more MoO42- than these organisms, despite ancestors of methanogens likely being where Nif originated6,9./p>1000 nM MoO42- was provided (Fig. 4d). Strikingly, cells provided with FeS2 grew well under all Mo concentrations tested, including when 0 µM MoO42- was added (Fig. 4c). After this experiment, abiotic reactors containing media and FeS2 (no MoO42- added) were analyzed by ICP-MS and were determined to have background (contaminant) Mo ranging from 10 to 30 nM despite using ACS-grade chemicals and acid-washed glassware. Thus, Fe(II)/HS--grown N2-fixing cells required >500 nM MoO42- to achieve near-optimal growth rates and yields whereas FeS2-grown N2-fixing cells required <30 nM MoO42-./p>10-fold lower than previously reported for this strain42. Further, MmS2 cells can achieve optimal growth rates and yields at MoO42- concentrations that are at levels ~100-fold lower than previously reported42. Despite similar growth rates for the FeS2 conditions at different MoO42- concentrations, there was a positive trend in the cell yield with increasing MoO42- that indicates higher MoO42- concentrations are still beneficial to these cells (Fig. 4d). These findings are consistent with other studies that have shown N2 fixation at low Mo concentrations with cells grown under non-sulfidic conditions81,82. Notably, the low levels (10-30 nM) of MoO42- shown to support N2 fixation herein are similar to the inferred Mo concentrations of Proterozoic oceans83,84,85). Other studies investigating Mo requirements for other methanogen species fixing N2 found 1 to 10 µM MoO42- to be the optimal concentrations86,87. There is one other example of methanogens fixing N2 at low (<10 nM) MoO42- concentrations; Nishizawa et al. showed that isolates of Methanocaldococcus and Methanothermococcus from a hydrothermal vent could fix N2 with as low as 5 nM or 1 µM MoO42-, respectively59. This indicates that different methanogen species within the same hydrothermal environment (at different temperatures) can have very different Mo requirements. Importantly, these past experiments were all performed in the presence of >1 mM HS-, necessitating a re-evaluation of methanogens’, and other anaerobes’, ability to access MoO42- in the absence of high HS-. These data support the hypothesis that N2 fixation via Nif is more efficient in low HS- conditions where Mo is more bioavailable./p> ~3 × 107 cells per mL by centrifugation in 50 mL centrifuge tubes (Globe Scientific, Mahwah, NJ) for 30 min at 4696 x g at 4 °C. The supernatant was removed using a line and needle under low-vacuum and the cells were resuspended in 8 mL of basal medium and transferred to a 15 mL centrifuge tube (Globe Scientific)./p> 
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