레자주린 환원을 이용한 Ascaris suum L3의 대사 활성 정량화

기생충 및 벡터 16권, 기사 번호: 243(2023) 이 기사 인용

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측정항목 세부정보

기생충 감염은 인간의 중요한 공중 보건 문제이며 가축 및 가축 복지에 훨씬 더 큰 영향을 미칩니다. 구충제 약물 스크리닝 분석에 대한 현재 판독값은 주관적이고 힘들며 처리량이 낮을 수 있는 단계 개발, 이동 또는 운동성입니다. 이 연구의 목적은 돼지에서 경제적 관련성이 높은 기생충인 Ascaris suum 3단계 유충(L3)의 대사 활동 변화를 평가하기 위해 resazurin을 사용하는 형광 측정 기술을 적용하고 최적화하는 것이었습니다.

Ascaris suum L3은 6~8주된 발아 및 자당 농도 변화가 풍부한 알에서 기계적으로 부화되었습니다. Resazurin 염료와 A. suum L3를 96웰 미세역가 플레이트에서 적정하고, 24시간 배양 후 형광측정법으로 resazurin 감소 활성을 평가했습니다. 형광 현미경을 사용하여 유충 내의 레자주린 감소 부위를 국소화했습니다. 마지막으로 A. suum L3를 열, 메탄올, 구충제 등 다양한 스트레스 조건에 노출시키고 레자주린 감소 활성을 통해 유충 대사에 미치는 영향을 조사했습니다.

우리는 비형광 염료 레자주린이 중요한 A. suum L3 내부에서 형광 레조루핀으로 감소되어 배양 배지로 방출된다는 것을 보여줍니다. 최적의 분석 매개변수는 웰당 100~1000L3, 레자주린 농도 7.5μg/ml, 37°C/5% CO2에서 24시간 동안 배양하는 것입니다. A. suum의 L3 주변의 손상되지 않은 L2 덮개는 레자주린의 흡수를 완전히 방지하는 반면 덮개가 없는 L3에서는 유충 중장을 따라 가장 강렬한 형광 신호가 관찰됩니다. 메탄올이나 열에 노출된 L3은 레자주린 환원 활성이 점차 감소합니다. 또한 이버멕틴 0.625μM, 메벤다졸 5μM, 티아벤다졸 10~100μM에 24시간 노출하면 유충 대사 활동이 각각 55%, 73%, 70%~89% 크게 감소했습니다.

함께, 우리의 결과는 대사 스트레스 요인과 구충제 모두 A. suum L3의 레자주린 감소 활성을 유의미하고 재현 가능하게 감소시켜 제안된 분석법을 시험관 내에서 A. suum L3의 대사 활성을 평가하는 민감하고 사용하기 쉬운 방법으로 만든다는 것을 보여줍니다. .

위장 선충의 방제는 주로 인간과 동물 모두의 화학 요법에 의존합니다. 그러나 재발성 치료 및 재감염, 현재 사용 가능한 구충제 종류의 제한[49], 약물 효능 감소에 대한 보고 증가, 벤즈이미다졸 및 이버멕틴과 같은 일선 구충제에 대한 내성 진화로 인해 구충제 연구의 중요성에 대한 인식이 높아졌습니다[19, 22 , 30, 38]. 토양 전파 기생충(STH)에 대한 신약의 빠른 발견은 주로 약물 효과를 평가하기 위한 객관적인 고처리량 스크리닝 방법의 부족으로 인해 방해를 받습니다[1, 20, 47].

운동성과 형태에 대한 현미경 평가가 현재 유충의 약물 효능을 평가하는 데 사용되는 방법을 지배합니다. 일반적으로 이러한 접근법은 시간이 많이 걸리고 힘들며 주관적인 경향이 있으므로 처리량이 많은 스크리닝에는 적합하지 않습니다. xCELLigence System[40] 및 wMicroTracker System™[24, 37]과 같은 장치는 Caenorhabditis elegans 및 몇몇 기생충 기생충 종을 사용한 고처리량 약물 스크리닝에 대해 검증되었지만 판독은 전적으로 운동 활동으로 제한됩니다. 따라서 신약 후보를 스크리닝할 때 다양한 매개변수를 다루는 조합 접근법(예: 운동 활동과 같은 일반적인 판독값과 전기생리학적 또는 대사 활성과 같은 추정 작용 모드에 대한 특정 판독값이 결합됨)이 논의됩니다[12].

운동성 외에도 유충 단계에 따라 측정 가능한 제품으로 변환되는 대사 활동의 지표 염료를 사용하여 선충 생존력을 평가할 수 있습니다. 테트라졸륨 염료 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT), 플루오레세인 디아세테이트(FDA), 파라니트로페닐 인산염(pNPP)과 같은 다양한 대사 지표가 기생충에 대해 테스트되었습니다. ) [34] 및 세포 투과성 염료 resazurin. Resazurin은 NADPH 의존성 resazurin의 resorufin으로의 환원을 기반으로 하며 광범위한 표적에서 포유류 세포 성장과 세포 대사를 모니터링하는 데 널리 사용됩니다[23]. 레사주린 감소 분석은 지금까지 성체 주혈흡충 종[25, 26]과 4단계 유충(L4) 및 성체 Trichuris muris[39]의 약물 스크리닝에 적용되었습니다. 우리가 아는 한, Ascaris spp.의 resazurin 감소 분석의 잠재력에 대한 데이터입니다. 기생충은 없지만 인간과 돼지 모두에서 전 세계적으로 가장 흔한 STH 중 하나입니다 [15, 17, 51].

95%. Of note, larvae inside eggs that we obtained from both the 23% and 25% sucrose layers appeared fully embryonated and were therefore pooled and used for all subsequent in vitro assays./p> 0.99). For larvae treated with 1.5 vol% methanol for 24 h, no significant impact on resazurin reduction activity was detected. However, gradual impairment of resazurin reduction activity was observed at concentrations of 3%, 6%, and 12%, resulting in significantly weaker fluorescence signals by 20% (P ≤ 0.05), 45% (P ≤ 0.0001), and 70% (P ≤ 0.0001), respectively. Methanol at 25% completely abrogated resazurin reduction. In the control, methanol itself at concentrations of 25% did not notably change fluorescence characteristics of resorufin (Additional file 2: Fig. S2). A gradual decrease in resorufin production was measured with increasing methanol concentrations. Four-parameter logistic regression revealed a half-maximal effective concentration (EC50) = 6.8% (df = 26, R2 = 0.95, 95% CI for EC50 = 4.3–9.2%) for methanol (Additional file 3: Fig. S3). Overall, for A. suum L3 exposed for increasing times to 60 °C or increasing methanol concentrations, we observed a gradually measurable decrease in resazurin reduction activity in the larvae./p>

1.14 mM in A. suum L4 (intestinal isolates 14 days post-infection). However, we were not able to reproduce an ivermectin concentration of 1.14 mM without precipitation of the drug in 0.5% DMSO. Therefore, we titrated ivermectin in 0.5% DMSO (in H2O) and detected turbidimetrically its maximum solubility at 1.56 µM in H2O (Additional file 4: Table S1). Moreover, the solubility of ivermectin in HBSS-AB was lower due to medium components like salts, sugar and antibiotics, which reduced the maximum soluble concentration to 625 nM. At this concentration of ivermectin, we observed 55% reduction in the activity of resazurin reduction in the L3, which consequently indicates a considerably lower EC50 value for A. suum L3 than for A. suum L4 observed by Hu et al. [16]. Hansen et al. [14] reported for ivermectin an IC50 of ~ 1 µM in A. suum L3, which is closer to our observations. However, for C. elegans, significant effects were observed at considerably lower ivermectin concentrations (0.6–20 nM ivermectin) [3, 12]. On the one hand, this may indicate that the resazurin reduction assay is less sensitive for detecting the effects of ivermectin on A. suum L3 compared to in vitro assays in other nematodes. On the other hand, together with the observations from Hu et al. [16] and Hansen et al. [14], it is conceivable that A. suum larvae are less susceptible to ivermectin than C. elegans larvae. The impact of thiabendazole and mebendazole on A. suum L3 have been investigated so far by Zhao et al. [50], who reported an EC50 values in the range of 2.3–150 nM using an agar migration assay for drug effect evaluation after 24 h drug treatment. However, 1000-fold higher concentrations of these anthelmintics resulted in significant but not complete inactivation of resazurin reduction activity by 73% to 89% in the present study. The direct comparison of the studies is difficult because the drug effects were evaluated using different methods. However, the resazurin reduction assay might be less sensitive in detecting impairments of larval locomotion rather than the agar migration assay but might provide a better sensitivity for detecting impairments of larval metabolic activity./p>

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